細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法

細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法是判斷供試品中細(xì)菌內(nèi)毒素是否符合規(guī)定。 內(nèi)毒素(Endotoxin)即革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的脂多糖，其毒性成分為類脂A。菌體死亡崩解后釋放出來。細(xì)菌內(nèi)毒素檢查包括兩種方法，即凝膠法和光度測定法，后者包括濁度法和顯色基質(zhì)法。供試品檢測時，可使用其中任何一種方法進(jìn)行試驗(yàn)。當(dāng)測定結(jié)果有爭議時，除另有規(guī)定外，以凝膠法結(jié)果為準(zhǔn)。

臨床意義
熱原主要是細(xì)菌釋放的一種內(nèi)毒素，熱原進(jìn)入機(jī)體血液循環(huán)系統(tǒng)會引起發(fā)熱等一系列不良反應(yīng)，因此，注射劑熱原或細(xì)菌內(nèi)毒素檢查是保證注射劑安全性的重要質(zhì)量指標(biāo)。 異常結(jié)果：臨床上在進(jìn)行靜脈滴注大量輸液時，由于藥液中含有熱原，病人在0.5-1h內(nèi)出現(xiàn)冷顫、高熱、出汗、昏暈、嘔吐等癥狀，高熱時體溫可達(dá)40℃，嚴(yán)重者甚至可休克。

注意事項(xiàng)
在細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法的建立中，計(jì)算內(nèi)毒素限值L、MVD和MVC時，需要注意大人用劑量、產(chǎn)品規(guī)格、鱟試劑的靈敏度等重要的參數(shù)，因?yàn)橛?jì)算錯誤會導(dǎo)致后續(xù)的所有努力均告失敗。常見的問題有： (1)臨床用藥劑量確定不正確，僅用常規(guī)用藥劑量，未考慮臨床可能的人體大用藥劑量和給藥途徑，在限值計(jì)算公式L=K/M中，由于對K值及M值的定義模糊，使K值及M值賦值不準(zhǔn)確，終導(dǎo)致限值計(jì)算錯誤。例如，某注射劑臨床成人每次靜脈滴注給藥40-80mg，嬰兒(三個月以上)靜脈滴注給藥每次10-20mg。按成人(體重60kg)劑量計(jì)算限值為3.75EU/mg，而嬰兒體重僅為5kg左右，計(jì)算限值約為1.25EU/mg，如果不考慮臨床每公斤體重大用藥劑量，細(xì)菌內(nèi)毒素限值就會出現(xiàn)較大的差別。 (2)有的申報(bào)品種細(xì)菌內(nèi)毒素限值不是根據(jù)臨床用量計(jì)算出來，而是根據(jù)同品種熱原檢查的劑量推算出來的，造成限值錯誤。 (3)有的品種細(xì)菌內(nèi)毒素限值從國外藥典抄來，沒有考慮該品種國內(nèi)上市的臨床使用劑量及中國人與國外人均體重等的差異，也造成限值確定不正確。 (4)錯誤的計(jì)算日給藥劑量(一日內(nèi)多次給藥)。 (5)在品種規(guī)格(濃度)發(fā)生變化時，計(jì)算MVD沒有進(jìn)行調(diào)整。 (6)建立方法時所用的大給藥劑量已經(jīng)超出了臨床所用劑量等。

檢查過程
（1）細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品為基準(zhǔn)物進(jìn)行標(biāo)定，確定基重量的相當(dāng)效價。每1mg工作標(biāo)準(zhǔn)品效價應(yīng)不小于2EU，不大于50EU，并具備均一性和穩(wěn)定性的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。效價測定方法如下：每批工作標(biāo)準(zhǔn)品至少取4支樣品，使用同一批號鱟試劑、同1支標(biāo)準(zhǔn)品。每支工作標(biāo)準(zhǔn)品按重量、標(biāo)準(zhǔn)品按單位，分別用內(nèi)毒素檢查用水稀釋制備一系列2倍稀釋度的內(nèi)毒素溶液，與鱟試劑反應(yīng)，當(dāng)4支工作標(biāo)準(zhǔn)品的反應(yīng)終點(diǎn)的對數(shù)均值的標(biāo)準(zhǔn)差(S)小于0.365時，計(jì)算4支工作標(biāo)準(zhǔn)品的反應(yīng)終點(diǎn)的幾何平均值(以ng/mg表示)及標(biāo)準(zhǔn)品的反應(yīng)終點(diǎn)值以(以EU/mg表示)，按下式計(jì)算。
（2）試驗(yàn)準(zhǔn)備 本法所用的器皿需經(jīng)處理，除去可能存在的外源性內(nèi)毒素常用250℃干烤30分鐘或180℃干烤2小時，也可用其他適宜方法。試驗(yàn)操作過程應(yīng)防止微生物的污染。 試驗(yàn)前需核對使用批號鱟試劑的靈敏度標(biāo)示值，應(yīng)符合規(guī)定。裝量加入配帶的鱟試劑溶劑。溶解后，為鱟試劑溶液，備用。 供試品的稀釋：使用批號鱟試劑的靈敏度標(biāo)示值小于供試品的內(nèi)毒*時，按下式計(jì)算，用內(nèi)毒素檢查用水將供試劑品稀釋后進(jìn)行檢查。 供試品的稀釋倍數(shù)=X/λ X：供試品的內(nèi)毒素*內(nèi)毒素*(EU/ml) λ：供試品鱟度劑靈敏度標(biāo)示值(EU/ml)
（3）檢查裝有0.1ml鱟試劑溶液的10×75mm試管(或0.1ml/支規(guī)格的鱟試劑原安瓿)4支，其中2支加入0.1ml供試品作為試品管，1支加入2λ內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品0.1ml作為陽性對照管，1支加入配帶的鱟試劑溶液0.1ml作為陰性對照管。將試管輕輕混勻后，封閉管口，垂直放入37±1℃水浴中，保溫60±2分鐘。保溫過程和拿取試管要小心，避免因受到振動造成陰性結(jié)果。
（4）結(jié)果判斷 將試管從水浴中輕輕取出，緩緩倒轉(zhuǎn)1800時，管內(nèi)凝膠不變形，不從管壁滑脫者為陽性記錄為(+)凝膠不能保持完整并從管壁滑脫者為陰性，記錄為(-)。供試品2管如為(-)，應(yīng)認(rèn)為符合規(guī)定，不再進(jìn)行熱原檢查法(家兔法)試驗(yàn)。如2管均為(+)，應(yīng)認(rèn)為不符合規(guī)定。如2管中1管為(+)，1管為(-)，按述方法另取4支供試品管復(fù)試，4管中有1管為(+)即認(rèn)為不符合規(guī)定。除正文另有規(guī)定外，有符合規(guī)定的供試品應(yīng)再以熱原檢查法(家兔法)試驗(yàn)，并根據(jù)的結(jié)果判定。 供試品細(xì)菌內(nèi)毒素的*應(yīng)符合各品種正文下的規(guī)定。 陽性對照為(-)或陰性對照為(+)，試驗(yàn)無效。
附： 滅菌注射用水、注射用水、氯化鈉注射液、5%和10%葡萄糖注射液細(xì)菌內(nèi)毒素檢查。

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